Hoạt động sinh học LRRK2-IN-1 CAS 1234480-84-2

Trong ống nghiệm

Kết quả tải nạp kiểu hoang dã và G2019S cho tín hiệu TR-FRET cao hơn 2,5 lần có thể bị ức chế bởiLRRK2-IN-1theo cách phụ thuộc vào liều với các giá trị IC50 lần lượt là 0,08MM và 0,03MM [1]. LRRK2-IN-1 sở hữu IC50 45 nM để ức chế DCLK2 và thể hiện IC50 lớn hơn 1 LờiM khi được đánh giá trong các thử nghiệm sinh hóa cho AURKB, CHEK2, MKNK2, MYLK, NUAK1 và PLK1. LRRK2-IN-1 được xác nhận là ức chế MAPK7 với EC50 là 160 nM. LRRK2-IN-1 gây ra sự ức chế phụ thuộc liều của sự phosphoryl hóa Ser910 và Ser935 kèm theo mất 14-3-3 liên kết với cả hai loại LRRK2 và LRRK2 [G2019S] được chuyển hóa ổn định vào các tế bào HEK293 [2]. LRRK2-IN-1 có khả năng gây độc tế bào vừa phải với IC50 là 49,3 sựM trong các tế bào HepG2. LRRK2-IN-1 thể hiện độc tính gen trong sự hiện diện và vắng mặt của S9 ở mức 15,6 và 3,9 ĐM, tương ứng [3]. LRRK2-IN-1 ức chế sự tăng sinh, di chuyển và gây chết tế bào với dấu hiệu apoptosis của tế bào HCT116 và AsPC-1 [4] ..

Trong Vivo

LRRK2-IN-1 (100 mg / kg, ip) gây ra sự khử phospho của LRRK2 trong thận của chuột [2]. Tiêm Peritumoral của LRRK2-IN-1 (100 mg / kg) dẫn đến giảm đáng kể khối lượng khối lượng và trọng lượng của xenograft khối u AsPC-1 [4].

Xét nghiệm Kinase

Hoạt động GST-LRRK2 (1326-2527), GST-LRRK2 [G2019S] (1326-2527), GST-LRRK2 [A2016T] (1326-2527) và GST-LRRK2 [A2016T + G2019 ) enzyme được tinh chế bằng glutathione sepharose từ tế bào HEK293 lysate 36 h sau khi truyền nhất thời các cấu trúc cDNA thích hợp. Các xét nghiệm peptide kinase, được thực hiện thành hai lần, được thiết lập trong tổng thể tích 40 PhaL chứa 0,5 lượngg LRRK2 kinase (với độ tinh khiết khoảng 10% cho nồng độ cuối cùng là 8 nM) trong 50 mM Tris / HCl, pH 7,5, 0,1 mM EGTA, 10 mM MgCl2, 20 PhaM Nictide, 0,1 KhănM [-32P] ATP (500 cpm / pmol) và nồng độ chất ức chế được chỉ định hòa tan trong DMSO. Sau khi ủ 15 phút ở 30 ° C, các phản ứng được chấm dứt bằng cách phát hiện 35 PhaL của hỗn hợp phản ứng trên giấy phosphocellulose P81 và ngâm trong axit photphoric 50 mM. Các mẫu được rửa rộng rãi và sự kết hợp của [-32P] ATP vào Nictide được định lượng bằng cách đếm Cerenkov. Giá trị IC50 được tính toán với GraphPad Prism bằng phân tích hồi quy phi tuyến tính.

Xét nghiệm tế bào

Các tế bào (104 tế bào trên mỗi giếng) được gieo vào một đĩa nuôi cấy mô 96 giếng trong ba lần. Các tế bào được nuôi cấy với sự hiện diện của LRRK2-IN-1 với DMSO như một phương tiện ở 0, 0,31, 0,63, 1, 2 và 5, 10 và 20 M. Sau 48 giờ xử lý, 10 μL thuốc thử TACS MTT được thêm vào từng giếng và các tế bào được ủ ở 37 ° C cho đến khi kết tủa tinh thể tối xuất hiện trong các tế bào. 100 μL 266 mM NH4OH trong DMSO sau đó được thêm vào giếng và đặt trên máy lắc đĩa ở tốc độ thấp trong 1 phút. Sau khi lắc, tấm được phép ủ trong 10 phút tránh ánh sáng và OD550 cho mỗi giếng được đọc bằng đầu đọc vi bản. Các kết quả được tính trung bình và được tính bằng tỷ lệ phần trăm của điều khiển DMSO (phương tiện) + / - lỗi tiêu chuẩn của giá trị trung bình.

Quản trị động vật

LRRK2-IN-1được hòa tan trong Captisol và được tiêm bằng cách tiêm trong màng bụng vào chuột C57BL / 6 chuột hoang dã với liều 100 mg / kg. Chuột đối chứng được tiêm một lượng Captisol tương đương. Tại thời điểm 1 và 2 giờ, chuột bị dập tắt do trật khớp cổ tử cung và mô thận và não nhanh chóng được mổ xẻ và đông lạnh trong nitơ lỏng.

Người giới thiệu

[1]. Hermanson SB và cộng sự. Sàng lọc các chất ức chế Novel LRRK2 bằng cách sử dụng Xét nghiệm tế bào TR-FRET thông lượng cao cho Phosphoryl hóa LRRK2 Ser935.PLoS One. 2012; 7 (8): e43580. Epub 2012 ngày 28 tháng 8.

[2]. Đặng, Xianming., Et al. Đặc điểm của một chất ức chế chọn lọc của bệnh Parkinson' kinase LRRK2. Sinh học hóa học tự nhiên (2011), 7 (4), 203-205.

[3]. Koshibu K, et al. Thay thế cho LRRK2-IN-1 cho các nghiên cứu dược lý về bệnh Parkinson' Dược lý. 2015; 96 (5-6): 240-7.

[4]. Weygant N, et al. Chất ức chế kinase phân tử nhỏ LRRK2-IN-1 cho thấy hoạt động mạnh mẽ chống lại ung thư đại trực tràng và tuyến tụy thông qua sự ức chế kinase giống như doublecortin 1. Mol Cancer. 2014 ngày 6 tháng 5; 13: 103